Laborinformationen

Next Generation Sequenzierung:

Verbesserte HIV-Resistenztestung vor oder unter antiretroviraler Therapie

Ziel einer antiretroviralen Therapie (ART) ist die maximale Absenkung der Viruskonzentration (Viruslast) im Blut. Gelingt dies nicht in ausreichendem Maße, kommt es durch den Selektionsdruck der Medikamente zur Resistenzentwicklung.

Zur deren Früherkennung wird die genotypischen Resistenzbestimmung herangezogen, idealerweise bevor es zu einem Anstieg der Viruskonzentration (Viruslast) kommt.

Die etablierte Labormethode ist die Identifizierung resistenzvermittelnder Mutationen durch Sequenzierung relevanter Abschnitte des HIV-Genoms. Mit der Sanger-Sequenzierung (Kettenabbruch-Sequenziermethode) können Subpopulation erkannt werden, wenn diese mit einem Anteil von mindestens 20% der Gesamtviruspopulation vorliegen.

Welche Vorteile besitzt die neue Sequenziermethode (Next Generation Sequencing)?

Mit neuen Sequenziertechniken können deutlich sensitiver resistente HI-Viren als in der Vergangenheit erkannt werden. Dies ermöglicht eine frühere Anpassung der Therapie.

Meist werden resistente HIV-Partikel in einem Gemisch mit sensiblen Viren gefunden. Mit der neuen Sequenziermethode werden alle Virusvarianten klonal amplifiziert und parallel sequenziert. Daher ist die neue Methode deutlich sensitiver. Es können noch mindestens 10% der Subpopulationen identifiziert werden. Zudem werden erheblich mehr Sequenzierdaten generiert. Dies verbessert die Datenqualität.

Welche Zielgene werden sequenziert?

Die wichtigsten Medikamente richten sich gegen die Reverse Transkriptase, die Protease und die Integrase. Diese Enzyme sind auf dem HI-Virusgenom kodiert. Eine erworbene Unempfindlichkeit zeigt sich immer durch Mutation von Basen in den jeweiligen Genen. Hat diese einen Aminosäureaustausch auf Proteinebene zur Folge (missense- oder nonsynonymous mutation), kann dies zu Medikamentenresistenzen führen

Wie entwickelt sich Resistenz?

Eine Viruspopulation ist genetisch nicht einheitlich (viele Quasispezies). Wird ein Virus spontan resistent, hat es unter der antiviralen Therapie einen Selektionsvorteil. Es beginnt erfolgreicher als die sensiblen Varianten zu replizieren. Werden bei Neuinfektionen resistente Viren übertragen, spricht man von „Primärresistenz“. Bei einer „Sekundärresistenz“ mutieren Viren während der Therapie. Ein Anstieg der Viruslast ist hier das erste Anzeichen eines Therapieversagens.

Wie ist die therapeutische und diagnostische Vorgehensweise?

Eine Bestimmung der Resistenzsituation wird empfohlen [Deutsch-Österreichische Leitlinien (Stand März 2010)]:

  • bei primärer oder kürzlicher Infektion
  • bei chronischer Infektion vor ART-Beginn
  • bei erstem Therapieversagen und vor ART-Wechsel
  • Umfangreicher ART-Vorbehandlung vor ART-Wechsel

Ein kurzfristiger Anstieg der Viruslast um mehrere hundert Kopien („Blip“) bedarf in der Regel keiner Änderung der Behandlung. Eine messbare Viruslast kann auch bedingt durch eine Medikamentenabsorbtionsstörung oder durch eine unzureichende Compliance seitens des Patienten verursacht sein.

 

Welche Subtypen gibt es und was ist ihre Bedeutung bei der Resistenzmessung?

Die meisten Daten zur Wirksamkeit antiretroviraler Medikamente beziehen sich auf den bei uns häufigsten Subtyp B. Resistenzvermittelnde Mutationen können für ein Medikament innerhalb verschiedener Subtypen variieren. Deshalb erfolgt mit der Resistenzbestimmung auch eine Subtypisierung des Virus.

Analytik

Methode: Next Generation Sequencing, Roche/454 GS Junior

Material: Ca. 10 ml EDTA-Blut ungeöffnet

Die aktuelle Viruslast sollte nicht unter 2000 Viren/ml liegen. Eine niedrige Viruslast kann die Sensitivität des Mutationsnachweises senken. Bei niedriger Viruslast wird das „Sanger“-Verfahren angewandt.

Gebührenpositionen

1. Genotypische HIV-Resistenztestung (Reverse Transkriptase und Protease)

GOÄ 4780/4782/3x4783/2x4787

EBM 32828

2. Genotypische HIV-Resistenztestung (Integrase)

GOÄ 4780/4782/1x4783/1x4787

EBM 32822

Quellen:

www.hivleitfaden.de/cms/index.asp

Deutsch-Österreichische Leitlinien:

www.daignet.de/site-content/hiv-therapie/leitlinien-1/Kurzfassung%20Deutsch-Osterreichische%20Leitlinien%20zur%20antiretroviralen%20Therapie%20der%20HIV-Infektion.pdf

Ansprechpartner

Dr. J. Bartel, Dr. M. Weizenegger